Arquitectura de microtúbulos variable en el parásito de la malaria

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1216 (2023) Citar este artículo

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Los microtúbulos son un elemento ubicuo del citoesqueleto eucariótico que normalmente consta de 13 protofilamentos dispuestos en un cilindro hueco. Este arreglo se considera la forma canónica y es adoptado por la mayoría de los organismos, con raras excepciones. Aquí, utilizamos crio-tomografía electrónica in situ y promedio de subvolumen para analizar el citoesqueleto de microtúbulos cambiantes de Plasmodium falciparum, el agente causante de la malaria, a lo largo de su ciclo de vida. Inesperadamente, diferentes formas de parásitos tienen estructuras de microtúbulos distintas coordinadas por centros organizadores únicos. En los merozoítos, la forma más estudiada, observamos microtúbulos canónicos. En las formas de mosquitos migratorios, la estructura de 13 protofilamentos se ve reforzada por hélices luminales interrumpidas. Sorprendentemente, los gametocitos contienen una amplia distribución de estructuras de microtúbulos que van desde 13 a 18 protofilamentos, dobletes y tripletes. Tal diversidad de estructuras de microtúbulos no se ha observado en ningún otro organismo hasta la fecha y probablemente sea evidencia de un papel distinto en cada forma del ciclo de vida. Estos datos proporcionan una visión única de un citoesqueleto de microtúbulos inusual de un patógeno humano relevante.

Los microtúbulos son un componente vital del citoesqueleto en todas las ramas de los eucariotas, formando pistas para el transporte intracelular, soporte estructural para la locomoción y husos para la segregación cromosómica. La polimerización de heterodímeros de α-/β-tubulina forma protofilamentos que interactúan lateralmente para ensamblarse en un cilindro hueco. El microtúbulo de 13 protofilamentos se considera canónico ya que esta estructura se ha observado con mayor frecuencia dentro de supergrupos eucariotas ampliamente estudiados. Si bien los primeros microscopistas electrónicos encontraron múltiples ejemplos de microtúbulos no canónicos1, la dificultad para purificar la tubulina nativa funcional de algunas especies y la dependencia excesiva de organismos modelo dieron como resultado que nuestra comprensión de la biología de los microtúbulos se basara principalmente en el estudio de los microtúbulos de los metazoos. Los ejemplos no canónicos, como los microtúbulos de 11 protofilamentos de células especializadas en nematodos2,3 y los microtúbulos de 15 protofilamentos de las células pilares del oído interno4,5, se consideran valores atípicos curiosos. El resultado es que, aunque los protozoos son un grupo grande y diverso, muchas de nuestras hipótesis sobre sus microtúbulos se han deducido de estudios de metazoos.

Los parásitos protozoarios eucariotas de Plasmodium spp., se basan en un andamio de microtúbulos subpeliculares ordenados (SPMT) como sus principales componentes estructurales del citoesqueleto. P. falciparum, el agente causante de la malaria, tiene un ciclo de vida complejo que alterna entre el mosquito vector y el huésped humano (Fig. 1). La extensa coevolución con los dos hospedadores ha dado como resultado que el patógeno utilice una multitud de tipos de células altamente especializadas y morfológicamente distintas, aquí denominadas formas. Aunque cada forma es maestra de un nicho distinto y morfológicamente variada, la presencia de SPMT es una característica unificadora. Los SPMT se encuentran debajo e interactúan con una doble membrana conocida como complejo de membrana interna (IMC) que se encuentra debajo de la membrana plasmática. Juntas, estas estructuras se conocen como la película que se encuentra en Apicomplexa, que incluye, por ejemplo, Toxoplasma gondii. La película se descompone en la transición y luego se reconstruye durante la maduración de cada forma del ciclo de vida, y cada vez se acompaña de un conjunto diferente de proteínas asociadas6,7. Esta reorganización de novo es una fuerza impulsora detrás de los cambios morfológicos sustanciales del parásito y los SPMT juegan un papel clave en este proceso8.

un ciclo de vida simplificado de Plasmodium de formas de parásitos estudiado aquí. Los esporozoítos se inyectan en el huésped. Después de diferenciarse en el hígado, los merozoítos se liberan a la sangre. La mayoría entra en un ciclo de replicación asexual (merozoítos) y un pequeño porcentaje se compromete a convertirse en gametocitos. Los gametocitos son captados por un mosquito y después de la fusión de gametos masculinos y femeninos en el intestino del mosquito, los cigotos se transforman en oocinetos. Los ookinetos atraviesan el intestino medio del mosquito, se convierten en ooquistes y forman miles de esporozoitos, que migran a las glándulas salivales. b Representación esquemática de nuestro flujo de trabajo: (i) los parásitos vivos se vitrifican en rejillas EM. (ii) las células se adelgazan en láminas y luego (iii) se obtienen imágenes mediante criotomografía electrónica (crio-ET). Las series Tilt se recopilan y se reconstruyen computacionalmente en volúmenes 3D. c Columnas 1–4: imágenes representativas de parásitos en diferentes pasos del flujo de trabajo. 1: composiciones de imágenes de fluorescencia de células que destacan la forma general del parásito. Recuadro: representación de dibujos animados de cada etapa. 2: Micrografías de microscopía electrónica de barrido (SEM) que muestran parásitos Plasmodium (algunos de color falso en amarillo y verde) rodeados de células huésped (asteriscos verdes). 3: micrografías que muestran vistas generales de las laminillas. 4: cortes a través de tomogramas de ejemplo.

Aunque las tubulinas eucariotas están muy conservadas, existen diferencias apreciables que hacen que los microtúbulos apicomplejos se destaquen. Los SPMT del parásito son extremadamente estables, resistentes a la mayoría de los protocolos de despolimerización clásicos, como los tratamientos en frío9, la adición de fármacos despolimerizantes de microtúbulos10 y detergentes11,12. Otra característica exclusiva de la tubulina apicomplexana es su formación de semitúbulos en forma de L que, con proteínas accesorias, forman una estructura helicoidal denominada conoide13,14. El conoide es una estructura especializada involucrada en la invasión. Aunque se caracterizan en Toxoplasma, los homólogos de algunos componentes conoides se expresan en Plasmodium spp.15.

Los microtúbulos ensamblados in vitro, a partir de tubulina purificada, constan de 9 a 16 protofilamentos, con diferentes distribuciones del número de protofilamentos según la especie y las condiciones utilizadas1,16. Como estas variaciones normalmente no se encuentran en las células, la estipulación de una población uniforme de microtúbulos de 13 protofilamentos debe establecerse durante la nucleación por factores externos. Existen cuatro mecanismos comunes para controlar el número de protofilamentos en un microtúbulo: creación de plantillas a través del complejo de anillo de tubulina γ (γTuRC)17,18, establecimiento de un ángulo específico entre protofilamentos a través de la unión lateral de proteínas como la doblecortina19,20, expresión de diferentes isoformas de tubulina21 o modificaciones postraduccionales22. En los metazoos, la nucleación de microtúbulos generalmente ocurre en los centrosomas (centros organizadores de microtúbulos, MTOC). En las formas invasivas de los parásitos apicomplejos, un MTOC estructuralmente diverso ubicado en su extremo apical, el anillo polar apical (APR), coordina el control espacial de orden superior de los SPMT23, pero el mecanismo específico aún se desconoce.

Para visualizar directamente la diversidad de microtúbulos en Plasmodium spp, tomamos imágenes de cuatro formas diferentes del ciclo de vida del parásito en condiciones nativas utilizando molienda de haz de iones enfocados criogénicos (FIB), tomografía electrónica (crio-ET) y promedio de subvolumen (SVA) (Fig. 1 ). Al revelar estas estructuras en su contexto nativo, en 3D, descubrimos una arquitectura citoesquelética inusual, en la que cada forma de parásito tiene una estructura de microtúbulos distinta y especializada, algunos de los cuales son sustancialmente diferentes de los microtúbulos canónicos.

Para determinar las estructuras in situ de los microtúbulos en diferentes formas de Plasmodium, realizamos FIB-milling y cryo-ET en dos mosquitos (esporozoitos y oocinetos) y dos formas humanas (merozoitos y gametocitos, Fig. 1). Realizamos un fresado FIB dirigido (Fig. 1b) para producir láminas con espesores entre 50 nm y 300 nm en lugares que contienen parásitos. Inicialmente, se utilizó microscopía de luz y electrónica correlativa (CLEM) para identificar parásitos vitrificados en rejillas EM. Más tarde descubrimos que sus formas distintivas en SEM (Fig. 1c, columna 2) permitían la orientación sin correlación. Para cada etapa adquirimos entre 50 y 100 tomogramas de ~20 laminillas, para obtener una buena cobertura de diferentes regiones subcelulares. Realizamos un picking manual para realizar SVA de forma exhaustiva en todos los microtúbulos, generando así modelos ultraestructurales completos y permitiendo el análisis estadístico. Para evitar posibles sesgos, los ~850 microtúbulos individuales del conjunto de datos se analizaron de forma independiente con SVA. Esto nos permitió investigar la variabilidad estructural, incluida la cantidad de protofilamentos y la polaridad relativa24, tanto dentro de cada célula como entre las cuatro formas del ciclo de vida.

Comenzamos nuestro estudio tomando imágenes de formas de parásitos aisladas del mosquito vector: esporozoitos y ooquinetos. Estas formas móviles se alargan con un andamio SPMT denso debajo del IMC. A primera vista, la luz de los SPMT tanto en los esporozoítos como en los ooquinetos contenía una (pseudo-) densidad helicoidal con una periodicidad de ~8 nm, en consonancia con las predicciones anteriores (Figs. 2, 3)11. Para generar mapas de densidad EM imparciales, SVA analizó 422 esporozoitos y 177 oocinetos SPMT sin aplicar ninguna (pseudo-) simetría. Ambas estructuras resultantes mostraron microtúbulos de 13 protofilamentos con hélices luminales dos veces interrumpidas (Figs. 2b-d, 3c). Estructuras similares, denominadas hélices luminales interrumpidas (ILH), se observaron por primera vez en extremos flagelares de espermatozoides humanos25, y más recientemente en espermatozoides equinos y porcinos26, y taquizoítos de Toxoplasma gondii14,27. Adoptamos la nomenclatura de Zabeo et al25. La ILH de T. gondii consta de proteínas similares a tiorredoxina 1 y 2 (TrxL1, TrxL2) y proteína de microtúbulos subpeliculares 1 (SPM1). Presumimos que la ILH en Plasmodium y Toxoplasma probablemente consista en proteínas homólogas: en primer lugar, Plasmodium spp. tienen homólogos de TrxL1 (PfTrxL1) y SPM1 (PfSPM1) pero carecen de TrxL2, que en el Toxoplasma ILH está presente en ambos, y llena por completo una de las dos interrupciones. Consistentemente, observamos exclusivamente hélices luminales dos veces interrumpidas en Plasmodium. En segundo lugar, compatible con la ILH compuesta por SPM1 y TrxL1 en Plasmodium, observamos una alta expresión en Plasmodium berghei (Pb) de PbSPM1-GFP y PbTrxL1-GFP en nuestras líneas de esporozoitos endógenamente etiquetados (Fig. S2). Finalmente, Plasmodium y Toxoplasma TrxL1 y SPM1 están altamente conservados12 (Fig. S1a, b), y el modelo de ensamblaje SPMT de T. gondii (pdb 7MIZ) encaja bien en nuestros mapas EM (Fig. 2c, d). Debido a la naturaleza asimétrica de la ILH, solo hay una forma de que la estructura de la ILH de T. gondii se pueda adaptar a la densidad EM de los SPMT de Plasmodium. Por lo tanto, sugerimos que P. falciparum ILH consta de 10 copias de PfTrxL1, probablemente con un número equivalente de PfSPM1 separados en dos medias lunas (Fig. 2c). Esto también nos proporcionó un método confiable para identificar tanto la posición de la costura como la ubicación de la tubulina alfa-beta en nuestra estructura (Fig. 2c, d).

a Corte a través de un tomograma que ilustra la arquitectura general de la película dentro de una célula. Se ve un SPMT entrando y saliendo del plano de corte. Recuadros: cortes a través del mapa EM (mostrado en B, C, D) colocados nuevamente en el tomograma en posiciones determinadas por SVA. b Cortes ortogonales a través del mapa EM. c Representación de isosuperficie del mapa EM con modelo pseudoatómico (7MIZ) ajustado a la densidad EM. p1-p13 = números de protofilamentos, línea punteada = posición de la costura. d Arriba: sección a través del mapa EM que muestra la posición de un dímero de tubulina α/β en relación con TrxL1. Abajo: proyección radial con un período de la ILH resaltado en púrpura. e El polo apical de un esporozoíto de P. falciparum con un conjunto completo de microtúbulos (13 azules + 1 verde). El APR está representado por una isosuperficie, los SPMT como modelos de alfiler, donde la cabeza del alfiler marca el centro y la línea está orientada hacia la costura. f Polo apical de esporozoito segmentado. La densidad de tubulina (13 protofilamentos) de dos SPMT se ocultó para revelar la ILH. Corte sin anotaciones a través del tomograma que se muestra en la Fig. S3a y el volumen completo en la película complementaria S1.

un corte de tomografía a través del extremo apical de un oocineto con SPMT orientados a lo largo del eje apico-basal. Una caricatura de un ookinete a la derecha muestra las posiciones centrales aproximadas de las laminillas en a, b y d. b Corte a través de la región proximal del ápice de un oocineto con SPMT cortados transversalmente, los colores de las anotaciones son los mismos que en a. Los SPMT se acercan al IMC a medida que el collar apical interno se estrecha (de izquierda a derecha). La orientación rotacional de los SPMT (centro a costura) se indica con flechas. c Secciones ortogonales a través del mapa EM determinado por SVA de ookinete SPMT. d Segmentación de una región proximal del ápice de un oocineto con SPMT cortados transversalmente, resaltando las dos capas de cuello apical entre las SPMT y el IMC. El conoide se muestra en verde. e Segmentación del polo apical de un oocineto. La densidad de tubulina de un SPMT se ocultó para revelar la ILH. El recuadro muestra un corte a través de un volumen promedio de la estructura periódica conoide. Corte sin anotaciones a través del tomograma que se muestra en la Fig. S3b y volumen completo en la película complementaria S2.

Aunque la mayoría de las estructuras de microtúbulos resueltas hasta la fecha tienen una sección transversal cercana a la circular, los microtúbulos de Plasmodium con ILH y, en menor medida, los microtúbulos de T. gondii con ILH (Fig. S1c, d) se aplanan a lo largo de un eje imaginario aproximadamente entre los protofilamentos 2 y 9. Esto implica que la ILH estabiliza el ángulo entre protofilamentos en ~ 26 °, desviándose en ~ 2 ° de los 27,7 ° teóricos de los microtúbulos canónicos de 13 protofilamentos (Fig. S1c, d). La desviación de la sección transversal circular se acumula en 5 subunidades y luego se compensa con un ángulo relativo de 37° entre los protofilamentos 6 y 7, y 12 y 13. Las comparaciones de la estructura predicha de TrxL1 de Plasmodium con la de T. gondii mostraron que el mayor la diferencia está en la hélice N-terminal (Fig. S1e), que es responsable de una gran parte de la interfaz subunidad-subunidad y puede desempeñar un papel en el aumento de la elipticidad.

En el extremo apical del oocineto, observamos una estructura consistente con un conoide clásico formado por una estructura única de tubulina (N = 1, Fig. 3e). La sección transversal de volumen promedio es consistente con el conoide basado en tubulina en forma de L descrito en T. gondii14. El conoide oocineto medía 70 nm de altura y 300 nm de diámetro, asemejándose a un estado retraído. Hasta hace poco, se pensaba que Plasmodium (perteneciente a la clase Aconoidasida, que significa sin conoide) no poseía un conoide. Nuestros datos validan la genética anterior, la microscopía de fluorescencia y los datos EM clásicos que insinúan la presencia de una estructura similar a un conoide en el ápice del oocineto15,28.

Según nuestros datos de forma de mosquito y las estructuras recientes de T. gondii, parecía plausible que la ILH sea una característica ubicua de los microtúbulos apicomplejos. Para verificar que esta es una característica universal en todas las formas del ciclo de vida, a continuación analizamos las formas de P. falciparum del huésped humano. Además, para evaluar si la presencia de una ILH es específica de los SPMT o de un componente general de microtúbulos, tomamos imágenes en dos puntos temporales del desarrollo de esquizontes. Para los SPMT, obtuvimos imágenes de esquizontes completamente segmentados (merozoítos), mientras que para los microtúbulos del huso apuntamos a los esquizontes en división. La etapa de sangre asexual, el merozoíto, que sale de un esquizonte maduro, es una célula pequeña con solo dos o tres SPMT (Fig. 4). Los merozoítos son de corta duración; para evitar la obtención de imágenes de células no viables, detuvimos los esquizontes antes de la salida utilizando un inhibidor de proteasa bien caracterizado (E64)29, lo que resultó en merozoítos en sacos de membrana de eritrocitos.

a Corte a través de un tomograma de un polo apical. Recuadro: corte a través del promedio de subvolumen de microtúbulos que muestra 13 protofilamentos. b Segmentación de un núcleo en un esquizonte en división con un cuerpo de huso parcial. Los cuatro complejos de poros nucleares observados en esta sección del núcleo están cerca del huso. Recuadro: corte a través de una isosuperficie del mapa SPMT EM. c Segmentación de un solo merozoíto dentro de un esquizonte completamente segmentado. Nota: para simplificar, el IMC está segmentado como una doble membrana continua, aunque se observaron múltiples discontinuidades. Corte sin anotaciones a través del tomograma que se muestra en la Fig. S3c y volumen completo en la película complementaria S3.

Inesperadamente y en contraste con las formas de mosquitos, no hubo ILH en los SPMT de merozoitos (Fig. 4a, c). El análisis por SVA mostró que los SPMT de merozoíto son canónicos, es decir, están compuestos por 13 protofilamentos. De manera similar, los microtúbulos del huso de los esquizontes en división eran canónicos y carecían de ILH (Fig. 4b). Sin embargo, a diferencia de los SPMT que no estaban tapados, los microtúbulos del huso contenían una densidad de tapado en sus extremos negativos que se asemejaba a γTuRC (Fig. S4c)30. Esto indicó que las estructuras del citoesqueleto de los microtúbulos de Plasmodium se alteran dependiendo de la etapa del ciclo de vida y que diferentes poblaciones de microtúbulos pueden nuclearse mediante distintos mecanismos.

Después de revelar que las estructuras de los microtúbulos son diferentes entre las formas de mosquito y la forma de sangre de merozoíto asexual, nos dispusimos a estudiar las SPMT en los gametocitos sexuales. El gametocito de P. falciparum se desarrolla desde una forma redonda a una alargada y finalmente falciforme a través de cinco etapas morfológicas. Los SPMT comienzan a polimerizarse en la etapa II y en la etapa IV rodean completamente el citoplasma. Enriquecimos gametocitos en diferentes etapas del proceso de maduración e investigamos sus microtúbulos.

La cobertura de la película aumentó con las etapas de desarrollo posteriores y, con ella, el número de SPMT en cada celda. En todas las etapas de gametocitos, las secciones transversales de SPMT tenían diámetros notablemente grandes y variables, que oscilaban entre 27 y 37 nm, y consistían en una mezcla de singletes, dobletes, tripletes (a menudo con geometrías inusuales) e incluso un cuadruplete (Figs. 5, S5 ). Esto fue inesperado ya que en todos los organismos estudiados hasta la fecha, los microtúbulos citoplasmáticos son tubos únicos (microtúbulos singlete) y estudios previos informaron microtúbulos de menor diámetro31. Los dobletes (que consisten canónicamente en 13 + 10 protofilamentos) y los tripletes se encuentran en los cilios y flagelos26,32, siendo los tripletes el sello distintivo de los centriolos. De acuerdo con los SPMT de merozoíto, no encontramos evidencia de una ILH en estos microtúbulos gigantes. SVA se realizó de forma independiente en cada uno de los ~ 170 singlete y ~ 30 A-túbulos de SPMT doble y sorprendentemente mostró que consistían en 13, 14, 15, 16, 17 o 18 protofilamentos (Fig. 5c, Tabla S1). Aunque algunos microtúbulos canónicos estaban presentes, estos solo representaban el 9% de la población, mientras que los microtúbulos de 17 protofilamentos eran los más frecuentes (40%) (Fig. 5c). Los dobletes también eran gigantes y sus túbulos A tenían una distribución similar, siendo los 17 protofilamentos los más comunes (Fig. S5b, c). Sorprendentemente, considerando la ubicuidad de un túbulo A de 13 protofilamentos en otros organismos, no había túbulos A con 13 protofilamentos. La diversidad en el número de protofilamentos distingue claramente a la población de gametocitos SPMT de todas las demás formas. Podría investigarse si esto se debe a una nucleación SPMT específica del gametocito oa un mecanismo diferente en comparación con los microtúbulos en otros compartimentos celulares.

a Micrografía que muestra una fila de secciones transversales de SPMT singlete y doblete y destaca el rango de tamaños. Se indican los números de protofilamentos (para dobletes del túbulo A). Se unieron micrografías en dos ángulos de inclinación diferentes para mostrar vistas transversales de SPMT. b Segmentación de un núcleo de gametocito en etapa III con un cuerpo polar del huso en un complejo de poro nuclear. Los colores de los microtúbulos corresponden a los números de protofilamentos como se muestra en c, dc Gráfico de barras de la distribución de diferentes números de protofilamentos en SPMT (azul) N = 155 y husos nucleares (lila) N = 31. Las distribuciones son significativamente diferentes (p = 5 × 10− 8, chi-cuadrado). d Isosuperficies de microtúbulos del promedio de subvolumen con números de protofilamentos de 13 a 18. e Representación esquemática de las diferencias en el diámetro de los microtúbulos. f Segmentación de un gametocito en etapa III con SPMT seccionadas transversalmente. Los colores de los microtúbulos corresponden a los números de protofilamentos como se muestra en c, d. '+/-' indica la polaridad de cada microtúbulo. Corte sin anotaciones a través del tomograma que se muestra en la Fig. S3d y volumen completo en la película complementaria S4.

Además de las SPMT, hay dos poblaciones de microtúbulos más en los gametocitos: huso nuclear (o hemishuso33) y citoplasmático. Los microtúbulos citoplasmáticos tienen una vida corta y solo aparecen en gametocitos en etapa temprana en el lado opuesto de la célula de la película en desarrollo34. En consecuencia, los microtúbulos citoplasmáticos son relativamente raros. Observamos una mezcla de números de protofilamentos (13 a 16, Fig. S5e) y aunque hubo una indicación de agrupamiento por tamaño de protofilamento, esto no pudo confirmarse debido a los bajos números. Los microtúbulos nucleares se observaron con frecuencia en parásitos de gametocitos en etapa III/IV y un cuerpo polar completo del huso estaba presente en una tomografía (Fig. 5b). Los microtúbulos del huso oscilaron entre 13 y 17 protofilamentos, siendo 15 los más comunes (Fig. 5b, c). Esto fue inesperado ya que, independientemente del número de protofilamentos, todos los extremos negativos estaban claramente cubiertos con una estructura que podría ser γTuRC (aunque está aplanada en relación con la forma canónica). En particular, γTuRC, hasta ahora, se ha descrito exclusivamente en microtúbulos canónicos (Fig. S4d). Juntos, estos datos sugieren que la amplia distribución del número de protofilamentos puede ser el resultado de la expresión diferencial de isoformas o la modificación postraduccional, en lugar de un mecanismo de nucleación.

Habiendo observado diferencias estructurales sustanciales entre las poblaciones de microtúbulos entre las cuatro formas individuales, enfocamos nuestro análisis en los ensamblajes apicales donde ocurre la nucleación de SPMT. En las formas de parásitos invasivos (merozoitos, esporozoitos y ooquinetos), los anillos proteicos (APR) en el polo apical actúan como MTOC únicos, coordinando los SPMT además de terminar el IMC. De acuerdo con esto, todos los SPMT en formas de mosquito y merozoítos tenían la misma polaridad, con sus extremos negativos en el polo apical y sus extremos positivos alcanzando el polo de la célula basal. En todas las formas invasivas, sus extremos negativos eran romos y carecían de una tapa de γTuRC, aunque puede haber proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) adicionales en la luz de los extremos negativos del oocineto (Fig. S4a). Sin embargo, a pesar de que las tres formas contenían SPMT de 13 protofilamentos con la misma polaridad, hubo diferencias a gran escala en la arquitectura de sus polos apicales (Figs. 2-4).

El vértice del merozoíto era el más simple, con solo dos o tres microtúbulos que irradiaban desde el APR (Fig. 4c). En lugar de distribuirse por igual alrededor de la APR, todos los SPMT se originaron en el mismo lado del anillo. Los esporozoítos contenían un mayor número de SPMT. En dos tomogramas, pudimos ver APR de esporozoitos completos con un conjunto completo de 13 espaciados muy juntos y un solo SPMT opuesto (Figs. 2e, f, S6). Los extremos negativos de SPMT estaban aparentemente en contacto directo (Fig. S6a) y al ras con el borde apical del APR. Sin embargo, cada SPMT tenía un ángulo de ataque diferente en relación con el eje de simetría rotacional del anillo que está inclinado aproximadamente 45 ° 35 desde el eje apico-basal del parásito (Fig. S6c, d). El contacto SPMT-APR, por lo tanto, debe permitir un alto grado de flexibilidad. Por el contrario, la orientación radial de SPMT estaba restringida, con los protofilamentos 6 a 9 preferentemente en contacto con el APR (Fig. S6c).

El ápice más elaborado se observó en los oocinetos, con dos capas concéntricas de proteína amorfa, en lugar de un solo anillo (Fig. 3). Debido a la gran diferencia en la morfología, preferimos el término collar apical (AC)15, pero APR es igualmente apropiado debido a la similitud funcional. Ambos anillos se separaron en tentáculos en su lado basal (Fig. 3b, d, e), con el AC interno en contacto directo y siguiendo los SPMT individuales hasta ~ 1 µm. Para acomodar la gran cantidad de SPMT presentes en esta forma (~ 50–60) en el extremo apical angosto, los extremos negativos de los microtúbulos se originaron en posiciones escalonadas desde el borde apical AC (Fig. 3e).

Las células de gametocitos no tienen una polaridad celular clara, a diferencia de las células claramente polares de las tres formas invasivas descritas antes (figs. 2-4). No observamos evidencia de una estructura similar a APR u otra estructura que pudiera actuar como un MTOC en los polos de los gametocitos, y los SPMT se originaron en posiciones aparentemente descoordinadas a lo largo de la longitud de la célula. A diferencia de las formas invasivas donde todos los SPMT tenían la misma polaridad con extremos negativos en el extremo apical, los SPMT de gametocitos tenían una polaridad aparentemente aleatoria (Fig. 5f, Tabla S1). Además, no hubo un patrón perceptible en la distribución de SPMT a lo largo del IMC con respecto a la cantidad de protofilamentos o túbulos secundarios (Fig. 5f, Tabla S1). Teniendo en cuenta que los SPMT en las tres formas anteriores carecían de un límite de γTuRC, inicialmente planteamos la hipótesis de que los factores de nucleación de SPMT pueden estar físicamente asociados con APR o AC. Sin embargo, el análisis enfocado de los extremos negativos de SPMT de gametocitos mostró que también estaban destapados (Fig. S4). Juntos, esto sugiere un mecanismo de nucleación independiente de γTuRC que no está asociado únicamente con el APR.

Aunque los parásitos Plasmodium alteran la estructura de sus microtúbulos, los MTOC y la organización de microtúbulos de orden superior en cada paso de su ciclo de vida, una característica unificadora es la interacción de los SPMT con el IMC. Para dilucidar si la interacción SPMT-IMC está mediada de la misma manera en todas las formas de parásitos, medimos la distancia más corta (dIMC) desde la superficie de cada SPMT hasta la membrana interna del IMC (Fig. 6). Un dIMC similar en todas las formas de parásitos sugeriría que las mismas proteínas están involucradas en la unión de los SPMT al IMC. Excluyendo los ensamblajes apicales, no hubo una diferencia significativa en el dIMC entre las cuatro formas de parásitos (con una mediana común de 18 nm y una desviación estándar de 10 nm, Fig. 6d). Esta distancia aumentó en el vértice del oocineto a ~50 y ~100 nm para acomodar la CA, pero la distancia desde la superficie SPMT hasta la superficie más cercana, la CA interna, fue comparable a dIMC (~13 nm, Fig. 6a) . Por lo tanto, mostramos que, aunque cada etapa tiene una estructura SPMT única, la distancia entre los SPMT y el IMC permanece constante entre las etapas. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las mismas proteínas vinculan los SPMT al IMC en todas las formas de parásitos analizadas.

Paneles a–c izquierda: diagramas de dispersión de la distancia SPMT individual (dIMC) y la orientación radial (φIMC) con respecto al IMC. Cada punto representa la mediana a lo largo de un solo SPMT. Los SPMT de ookinetos y esporozoítos tienen una polaridad definida, mientras que las orientaciones de los gametocitos son aleatorias (consulte la Fig. S7 para ver la representación de histograma 2D de estos datos). Las caricaturas de formas de parásitos indican las ubicaciones subcelulares donde se tomaron muestras de los puntos de datos: en el cuerpo celular o en el vértice. Derecha: volúmenes promedio de SPMT muestreados en las ubicaciones subcelulares indicadas. Aunque el promedio de subvolúmenes se centró en los SPMT, los componentes IMC y APR se pueden ver en los mapas EM después de extraer grandes subvolúmenes (bordes de 200 nm). Esto es una consecuencia de la distancia y orientación constantes de SPMT-IMC. Los dibujos animados por debajo del volumen promedio son modelos de la arquitectura de la película en cada ubicación. Tenga en cuenta que dado que el IMC envuelve el APR de esporozoíto en forma de toro, no fue posible medir un solo dIMC apical (los ángulos φIMC apicales se muestran en la Fig. S6b). El panel de gametocitos (c) muestra secciones a través de SPMT individuales en lugar de un promedio, para indicar sus orientaciones inconsistentes y diferentes números de protofilamentos. *Consulte los materiales complementarios para obtener detalles y suposiciones realizadas en la asignación de orientación de gametocitos. d Gráfica de violín que compara dIMC entre formularios, los anchos se escalan de acuerdo con la cantidad de datos.

Con la hipótesis de que un conector común une los SPMT al IMC en todas sus formas, y sabiendo que los SPMT en forma de mosquito tienen una orientación radial preferida (Figs. 2e, 3b, S6b, c, S7), nos propusimos buscar para el sitio de unión del enlazador. Un claro candidato, por ser un rasgo estructural asimétrico distintivo, era la costura. Medimos el ángulo, φIMC, entre la costura, el centro de los microtúbulos y el punto más cercano en la superficie del IMC (consulte la información complementaria para obtener detalles sobre la orientación de la costura).

El análisis del φIMC medio para todos los SPMT posibles reveló que solo los SPMT en etapa de mosquito tienen una polaridad radial establecida. Sorprendentemente, la costura apunta hacia afuera del IMC con el protofilamento 8 orientado hacia él (Figs. 6a, b, S6, S7). En contraste con las formas de mosquito, no se observó agrupación de φIMC en los gametocitos, lo que sugiere que en esta forma de ciclo de vida la proteína enlazadora no tiene una posición de unión específica (Fig. 6c).

Aunque estos resultados no encontraron un sitio de unión universal para el enlazador en todos los SPMT, sugirieron que la ILH estaba involucrada en el establecimiento de la orientación radial con respecto a la IMC. Inspeccionamos el mapa de densidad EM SPMT de la etapa del mosquito en busca de posibles pistas. Incluso a niveles de contorno bajos, no hubo densidad de enlace entre SPMT e IMC, lo que indica que cualquier proteína enlazadora es flexible o está presente con una ocupación baja. Sin embargo, hubo alguna evidencia de decoración radialmente asimétrica con una densidad de proteína desconocida entre los protofilamentos 10, 11 y 12, con una densidad adicional que emanaba radialmente hacia afuera de los protofilamentos 11 y 12 (Fig. S8). Si estas densidades corresponden a una parte del enlazador SPMT-IMC, es probable que se necesiten conexiones SPMT-IMC adicionales (posiblemente en el protofilamento 6 o 7) para establecer la orientación radial observada del protofilamento 8 que apunta hacia el IMC. Por lo tanto, aunque los detalles precisos de un conector aún no se han dilucidado, presentamos evidencia de decoración asimétrica y polaridad radial, que probablemente dependan de ILH, en los microtúbulos en forma de mosquito.

El parásito P. falciparum ha desarrollado un ciclo de vida complejo, moviéndose a través de múltiples tejidos diferentes dentro de su huésped humano y mosquito vector. Para cada nuevo nicho ambiental, el parásito sufre cambios morfológicos extremos. A medida que el parásito se transforma en nuevas formas especializadas para cada nicho, sus microtúbulos se desmontan y luego se vuelven a ensamblar en múltiples estructuras únicas y adecuadas para su propósito, coordinadas por MTOC inusuales (Fig. 7). Si bien el extremo apical del oocineto es el más elaborado e incluye un conoide basado en tubulina, los gametocitos se destacan entre las otras formas por su falta de APR y su población diversa de estructuras de microtúbulos (Figs. 5, 7).

a Representaciones de dibujos animados de las cuatro formas de Plasmodium analizadas. b Tabla que resume las principales diferencias arquitectónicas en las cuatro formas. Los contornos sólidos indican propiedades que probablemente estén correlacionadas: la presencia de un anillo polar apical establece la polaridad SPMT y la ILH está directamente relacionada con el establecimiento de la orientación de la costura con respecto al IMC.

Los gametocitos tienen una amplia gama y variedad de estructuras de microtúbulos que incluyen singletes con 13 a 18 protofilamentos y dobletes, tripletes y cuatrillizos gigantes. Una diversidad estructural tan grande hasta ahora no tiene precedentes, lo que plantea dudas sobre el mecanismo subyacente y el papel fisiológico. De acuerdo con nuestra comprensión actual, el número de protofilamentos está estrictamente controlado, pero aparentemente este no es el caso en los gametocitos. Los microtúbulos tienen la propensión a autoensamblarse in vitro, aunque en concentraciones considerablemente más altas que las fisiológicas. Este autoensamblaje espontáneo da como resultado poblaciones de microtúbulos con una amplia distribución de números de protofilamentos (9–16 para la tubulina de cerebro bovino)1,16. Sin embargo, es poco probable que un autoensamblaje sin nucleación sea responsable de los SPMT no canónicos gigantes en los gametocitos, ya que su polimerización está restringida a la superficie de las placas IMC en crecimiento, en lugar de espontáneamente en el citoplasma. Además, ocasionalmente observamos grupos de poblaciones de microtúbulos citoplasmáticos, posiblemente agrupados según el diámetro (Fig. S5e), lo que sugiere que hay un nivel de control disponible.

Un mayor número de protofilamentos podría deberse a modificaciones postraduccionales alteradas o a la expresión de una nueva isoforma de MAP o tubulina. Plasmodium spp. expresan una isoforma de tubulina β y dos de α. Aunque la tubulina α1 y α2 muestran una identidad de secuencia de ~95 %, hay varias sustituciones de aminoácidos en regiones clave. A la tubulina α2, por ejemplo, le faltan 3 aminoácidos en su extremo C (a menudo un objetivo para las modificaciones postraduccionales) y la región menos conservada en la secuencia corresponde a un bucle que puede mediar en las interacciones intraprotofilamento. Estos pequeños cambios podrían en última instancia dar lugar a alteraciones en la red de microtúbulos y promover la formación de túbulos B que conducen a dobletes y tripletes36. Además, estudios previos sobre isoformas de tubulina en humanos han demostrado que la fracción relativa de una isoforma dentro de un microtúbulo puede modular la red de microtúbulos37, proporcionando una posible explicación para el rango en el número de protofilamentos observado. Aunque es probable que la tubulina α2 se exprese en todas las formas del ciclo de vida, su expresión relativa es más alta en las etapas sexuales38,39. Esta isoforma no estaba presente en los microtúbulos purificados de etapas asexuales40, no es esencial en las formas asexuales41 y solo puede reemplazar parcialmente a la tubulina α1 en los esporozoítos de P. berghei42.

P. falciparum es la única especie de Plasmodium que produce gametocitos alargados43, y se ha demostrado que sus SPMT están poliglutamados, lo que puede influir en su estabilidad28,44. El gametocito en maduración ha disminuido su deformabilidad45, lo que desempeña un papel en la inhibición de la liberación prematura de gametocitos de los sitios de secuestro en la médula ósea, evitando así el aclaramiento esplénico46. Los gametocitos son más rígidos en la etapa IV, cuando se ensamblan todos los microtúbulos. Sin embargo, las celdas vuelven a ser deformables en la etapa V, cuando la mayoría de los SPMT se han desmontado, lo que sugiere un vínculo entre la rigidez de las celdas y los SPMT.

Esperamos que los microtúbulos gigantes sean significativamente más rígidos (menos propensos a doblarse) que la forma canónica. Se espera que la transición de 13 protofilamentos a 17 o 18 protofilamentos aumente en gran medida la rigidez de un microtúbulo individual, ya que se predijo que un cambio de 13 a 15 protofilamentos daría como resultado un aumento del 35 % en la rigidez47. Este aumento de la rigidez se evidencia, por ejemplo, en células mecanosensoriales donde sus microtúbulos de 15 protofilamentos están implicados en la mecanotransducción. Como la periferia de los gametocitos tiene un área de superficie limitada, un número limitado de microtúbulos puede encajar en la superficie interna del IMC. Por lo tanto, maximizar el número de microtúbulos así como ensamblar microtúbulos más grandes y rígidos puede permitir que los gametocitos de P. falciparum crezcan en su forma extendida y rígida y se desarrollen sin perturbaciones en sus huéspedes humanos hasta que maduren.

Las dos formas de mosquito, por otro lado, tienen sus propios SPMT únicos hechos de 13 protofilamentos y característicamente reforzados con una ILH. Nuestras observaciones contribuyen a una lista cada vez mayor de organismos que hacen uso de una ILH en su citoesqueleto de microtúbulos, que ahora incluye las SPMT de los apicomplejos14,27 y los cilios y flagelos de algunos mamíferos25,26. Con nuestras observaciones, parece probable que la ILH que consta de proteínas similares a TrxL1 y SPM1 se conserve en Apicomplexa, pero solo en algunas formas del ciclo de vida. El perfil de expresión de TrxL1 en los datos publicados es consistente con nuestra observación, con su transcripción fuertemente regulada al alza en oocinetos y esporozoitos y muy poca expresión relativa en estadios sanguíneos38,48. En nuestras líneas TrxL1-GFP y SPM1-GFP, vimos altos niveles de expresión en esporozoitos (Fig. S2). Curiosamente, en los mamíferos hay un homólogo de TrxL1 que se localiza en los cilios pulmonares y los flagelos de los espermatozoides (Txl-249 similar a la tiorredoxina) y un homólogo de SPM1 en los axonemas (estabilizador de los microtúbulos axonémicos SAXO250), lo que sugiere que la ILH puede ser un rasgo eucariótico.

Se ha formulado la hipótesis de que la ILH limita el recambio en el extremo positivo de los microtúbulos y fortalece las SPMT tanto en dirección longitudinal (a través de SPM1) como transversal (TrxL1)25,26. Un mutante nulo de SPM1 en T. gondii tenía una aptitud física reducida12. Esto no se observó en un segundo estudio, aunque los microtúbulos eran más susceptibles a los tratamientos químicos cuando faltaban SPM1 o TrxL127. Es notorio que la ILH ocurre en estructuras locomotoras, como cilios, extremos flagelares y formas deslizantes apicomplexas. Por lo tanto, postulamos que la ILH proporciona estabilidad sin sacrificar la flexibilidad, y si se producen roturas, SPM1 mantiene los extremos juntos, lo que permite la reparación o autocuración de SPMT. Cuando solo se requiere rigidez, los gametocitos de Plasmodium han desarrollado una hoja densa de SPMT con una gran cantidad de protofilamentos, dobletes y tripletes.

La función de los SPMT como elementos del citoesqueleto se basa en una conexión física con el IMC. Al estudiar el vínculo entre los SPMT y el IMC, encontramos que se estableció la orientación rotacional de los SPMT que contienen ILH con respecto al IMC. Sorprendentemente, la costura no estaba orientada hacia el IMC. Esto es consistente con y aclara los datos previos sobre la orientación de la costura de T. gondii14 solubilizado con detergente aplanado, pero sigue siendo sorprendente ya que la costura es la única característica de microtúbulo verdaderamente asimétrica a la que se puede acceder mediante MAP de unión externa. En cambio, la ILH podría establecer la orientación de rotación directamente. Los gametocitos, que carecen de ILH, tienen una polaridad radial aparentemente aleatoria. Nuestra evidencia de esto fue la gran variación del doblete φIMC, pero más allá de esto, también es difícil reconciliar el supergiro de los microtúbulos no canónicos con un enlazador que tiene preferencia por un protofilamento específico (ya que diferentes protofilamentos se dirigen hacia el IMC a medida que el microtúbulo giros). Proponemos que la polaridad radial de los SPMT de 13 protofilamentos en los merozoítos también es aleatoria, debido a la supuesta falta de una característica asimétrica como la ILH.

Hay dos mecanismos concebibles sobre cómo la ILH podría estar orientando a los SPMT. Ya sea un contacto directo entre un componente ILH y un MAP externo, o forzando a los SPMT en secciones transversales elípticas (Fig. S1), donde los ángulos inconsistentes entre los protofilamentos podrían reconocerse como sitios de unión. Observamos densidades débiles que emanan de los protofilamentos 11 y 12 y en las crestas entre los protofilamentos 9 a 12 (Fig. S8). Estas densidades no son consistentes con los MAP conocidos como la cinesina o la doblecortina, pero la resolución de nuestros mapas de densidad EM de simetría C1 no es lo suficientemente alta como para ser concluyente. No está claro si corresponden a un enlace SPMT-IMC putativo, considerando que no están orientados hacia el punto más cercano en el IMC. Un marco para comprender la evolución de la orientación rotacional asimétrica de los SPMT puede ser una hipótesis propuesta recientemente de que los SPMT se originan a partir de un flagelo antiguo51,52. La orientación de los SPMT que contienen ILH es aproximadamente consistente con la orientación del túbulo A en los axonemas con respecto a la membrana. Será necesario probar si esta polaridad radial es importante para la orquestación del deslizamiento direccional.

Las variaciones en las estructuras de los microtúbulos entre las formas de Plasmodium plantean la pregunta obvia; ¿Cómo se nuclean estos diferentes microtúbulos? Se ha sugerido que los SPMT con ILH podrían ser nucleados por SPM127. Luego, TrxL1 podría establecer el número de protofilamentos en 13 a través de la curvatura de su estado oligomérico. Esto parece plausible de forma aislada, pero no a la luz de nuestros nuevos datos. No explica cómo se nuclean los microtúbulos gigantes de los gametocitos o los SPMT de 13 protofilamentos de merozoitos, que carecen de ILH. Además, la curvatura de los protofilamentos unidos a TrxL1 se aparta de la de un microtúbulo canónico de 13 protofilamentos (Fig. S1) y hay un espacio en la ILH entre los protofilamentos 13 y 1 donde posiblemente se podrían insertar protofilamentos adicionales. γTuRC es un mecanismo de nucleación poco probable ya que los extremos negativos de SPMT se destaparon en todos los microtúbulos observados en todas las formas (Fig. S4). Aunque es posible que las tapas de γTuRC se hayan desmontado (la γ-tubulina se expresa en esquizontes, por ejemplo53), esto sería sorprendente debido a la estabilidad de los microtúbulos de Plasmodium. Es difícil especular sobre la naturaleza de la nucleación de microtúbulos gigantes en los gametocitos. Por un lado, se podría especular sobre una nucleación de SPMT independiente de γTuRC que permite números de protofilamentos de 13 a 18. Pero por otro lado, está la presencia de una estructura similar a γTuRC en los microtúbulos del huso, que sin embargo es incapaz de generar un microtúbulo homogéneo. población. Datos recientes sugieren que, al menos las SPMT iniciales en los gametocitos, están nucleadas en una placa centriolar ubicada en la membrana nuclear44. Aún será necesario explorar cómo se pueden lograr microtúbulos de diferentes diámetros y nuestra polaridad aleatoria observada de SPMT con este modelo. Juntos, estos datos pueden insinuar un nuevo mecanismo de nucleación SPMT y, con él, un objetivo potencial para los antipalúdicos.

En este trabajo revelamos la metamorfosis de las estructuras de microtúbulos a lo largo del ciclo de vida de P. falciparum. En el nivel más alto, la notable diversidad estructural nos obliga a reevaluar nuestras ideas preconcebidas sobre los microtúbulos canónicos resultantes de la dependencia excesiva de un pequeño número de organismos modelo. La alta resolución y la conservación estructural óptima de los datos in situ presentados aquí proporcionan un marco para integrar los resultados de otros métodos más reduccionistas, con el fin de obtener una imagen completa del citoesqueleto de un organismo. Esperamos que a medida que se estudien más tipos de células, utilizando estas técnicas disponibles ahora, la verdadera diversidad de estructuras de microtúbulos eucarióticos y sus funciones de nicho será mayor de lo previsto actualmente.

Se cultivaron formas de sangre de P. falciparum en glóbulos rojos humanos (O + o B + , Universitätsklinikum Eppendorf, Hamburgo, Alemania) al 5 % de hematocrito, 1 % de O2, 5 % de CO2 y 94 % de N2 a 37 °C, en RPMI medio completo que contiene 0,5% de Albumax II54.

Los esquizontes se recolectaron usando Percoll55 precalentado al 60 %, se lavaron una vez con RPMI precalentado, se resuspendieron en glóbulos rojos no infectados al 5 % en RPMI precalentado y se cultivaron durante 3 h, hasta que los parásitos salieron y reinvadieron. Los esquizontes no rotos se lisaron con sorbitol al 5%. El cultivo restante contenía anillos jóvenes con una ventana de sincronicidad de 3 horas.

Esquizontes 3D7 estrechamente sincronizados que expresan endógenamente GAPM2 marcado con GFP (proteína asociada al glideosoma con múltiples tramos de membrana 256,57) se aislaron de un cultivo de 10 a 20 ml (5 a 10 % de parasitemia) utilizando Percoll 55 al 60 %, lavado dos veces en pre- RPMI calentado y tratado con 1 µM del compuesto inhibidor de PKG 2 (proporcionado por el Dr. Mike Blackman, The Francis Crick Institute, Reino Unido)58,59 e incubado durante 6 h. Los esquizontes segmentados se lavaron una vez y luego se resuspendieron en RPMI precalentado sin Albumax o rojo fenol pero con la adición de E64 1 µM (Sigma) para permitir que la vacuola parasitófora se rompiera pero evitar la ruptura de la membrana de glóbulos rojos. Esto nos ayudó a identificar esquizontes en etapas muy avanzadas en el SEM. Las células se mantuvieron calientes y vitrificadas en una hora.

Las etapas de gametocitos se generaron mediante la sobreexpresión dirigida del factor de compromiso sexual GDV1 (desarrollo de gametocitos 1) utilizando una línea productora de gametocitos inducible (iGP) 3D7 como se describió anteriormente60 que sobreexpresa una versión etiquetada con GFP de la proteína del complejo de membrana interna de sutura PF3D7_1345600 (plásmido de 57). La expresión de GDV1-GFP-DD se logró mediante la adición de Shield-1 2 o 4 µM a un cultivo de parásitos que contenía 2–3 % de anillos. Shield-1 se mantuvo durante 48 h más hasta la reinvasión. La muestra se ajustó al 10% de parasitemia y se cultivó en RPMI suplementado con suero humano al 10% (grupo sanguíneo AB+) durante 10 días para permitir la maduración de los gametocitos. Para eliminar las formas asexuales no comprometidas, los gametocitos se trataron con N-acetil-D-glucosamina (GlcNac) 50 mM durante al menos 4 días. El medio de cultivo se cambió al menos una vez al día en una placa calefactora a 37 °C. Los estadios de gametocitos II, III, IV y V se aislaron en diferentes momentos durante la maduración de los gametocitos a partir de un cultivo de 20 ml utilizando Percoll precalentado al 60 %. Los gametocitos aislados se lavaron dos veces y luego se resuspendieron en RPMI precalentado sin albumax, suero o rojo fenol y se mantuvieron calientes (entre 15 min y 45 min) hasta inmediatamente antes de la congelación.

Esporozoítos de P. falciparum (cepa: NF54-ΔPf47-5'csp-GFP-Luc: que expresa una proteína de fusión GFP-Luciferase) bajo el control del promotor csp, integración genómica, sin marcador de selección61 preparados en TropIQ (Nijmegen, Países Bajos) Se alimentaron gametocitos a mosquitos Anopheles stephensi hembra de 2 días de edad. La infección por mosquitos se confirmó 7 días después de la infección mediante disección del intestino medio. A los 7 días posteriores a la infección, los mosquitos infectados recibieron una comida adicional de sangre no infecciosa para impulsar la producción de esporozoitos. Dos semanas después de la infección, los esporozoítos se aislaron mediante disección de glándulas salivales y se enviaron a Hamburgo a temperatura ambiente.

Los ookinetos se produjeron utilizando la línea PbRFP de P. berghei, una línea ANKA de P. berghei que expresa constitutivamente RFP. A dos ratones suizos hembra se les inyectaron por vía intraperitoneal 200 µl de fenilhidrazina (6 mg/ml en PBS) para estimular la reticulocitosis. Dos días más tarde, los ratones se infectaron por vía intraperitoneal con 20 x 106 iRBC PbRFP. Los ratones se sangraron tres días después de la infección y se transfirieron 500 µl de sangre a 10 ml de medio de oocineto (RPMI complementado con FCS al 20 % (v/v), hipoxantina 50 µg/ml y ácido xanturénico 100 µM, ajustado a pH 7,8 – 8,0) a 19 °C. Después de 22 h de cultivo, los cultivos de oocinetos se cubrieron con 5 ml de Nycodenz al 55 %/PBS y se centrifugaron durante 25 min a 210 xg sin freno. La interfase que contenía oocinetos purificados se recogió, se lavó en PBS y se sumergió inmediatamente en congelación para EM.

Las células se mantuvieron calientes en un bloque térmico a 37 °C junto al congelador de inmersión. Se aplicaron 3 µl de parásitos enriquecidos en una rejilla EM de malla 300 UltrAufoil R1.2/1.3 recién limpiada con plasma (Quantifoil) en una instalación con control de humedad. El exceso de líquido se secó manualmente y las rejillas se sumergieron en un depósito de etano/propano usando un émbolo manual. Las rejillas se almacenaron bajo nitrógeno líquido hasta la toma de imágenes.

Las rejillas se sujetaron en rejillas automáticas modificadas para la preparación de FIB62 y se cargaron en un microscopio de doble haz crio-FIB/SEM Aquilos o Aquilos2 mejorado (Thermofisher Scientific). Los conjuntos de mosaicos generales se registraron utilizando el software MAPS (Thermofisher Scientific) antes de recubrirlos con una fina capa de platino. Se identificaron buenos sitios con parásitos para la preparación de láminas antes de determinar el punto coincidente entre el haz de electrones y el haz de iones para cada punto mediante la inclinación de la etapa. Antes de la molienda, se depositó una capa de platino organometálico sobre las rejillas utilizando un GIS (sistema de inyección de gas). Las láminas se molieron manualmente hasta por debajo de 300 nm en una serie escalonada de corrientes decrecientes. El fresado se realizó en los ángulos más bajos posibles para aumentar la longitud de las láminas en las células delgadas. Finalmente, el pulido de todas las laminillas se realizó al final de la sesión lo más rápido posible pero siempre dentro de las 1,5 h para limitar la contaminación del hielo por la deposición de agua en la superficie de las laminillas. Antes de retirar las muestras, las rejillas se recubrieron con una fina capa final de platino. Las rejillas se almacenaron en nitrógeno líquido durante un máximo de 2 semanas antes de obtener imágenes en el TEM.

Las rejillas molidas con FIB se giraron 90 ° y se cargaron en un microscopio Titan Krios (Thermofisher) equipado con un detector de electrones directos K2 o K3 y un filtro de energía (Bio-) Quantum (Gatan). Los datos tomográficos se recopilaron con SerialEM63 con la rendija de selección de energía configurada en 20 eV. Los conjuntos de datos se recopilaron utilizando el esquema de adquisición de dosis simétrica en un rango de inclinación de ± 65° con incrementos de inclinación de 3°. Para todos los conjuntos de datos, se recopilaron y alinearon de 5 a 10 fotogramas sobre la marcha utilizando SerialEM y la fluencia total se mantuvo por debajo de 120e−/Å2. Se utilizaron defoci entre 3 y 8 μm de subenfoque para registrar las series de inclinación.

Los marcos se alinearon sobre la marcha en SerialEM; La estimación de CTF, el cambio de fase y la ponderación de dosis se realizaron en IMOD64. Las series de inclinación se alinearon en IMOD ya sea mediante el seguimiento de parches o mediante el uso de nanopartículas (probablemente oro o platino) en superficies de láminas como marcadores fiduciales. Los tomogramas se agruparon 4x y se filtraron en IMOD o utilizando Bsoft65.

SVA se realizó en PEET66 con tomogramas en intervalos progresivamente más bajos. Las coordenadas 3D iniciales (puntos del modelo o coordenadas de partículas) para SVA se generaron interpolando entre centros de microtúbulos trazados manualmente en IMOD, utilizando scripts basados ​​en TEMPy67 y utilizando las bibliotecas de Python Numpy, Scipy y Matplotlib68,69,70. Los vectores entre pares de puntos se usaron para establecer la orientación inicial del eje Y de la partícula (eje de pseudosimetría de microtúbulos). Cada microtúbulo se procesó por separado, se alineó con una referencia única (promedio bruto) generada al promediar las partículas respectivas con orientaciones iniciales (Fig. S9). Para determinar su polaridad y el número de protofilamentos, se aleatorizaron las rotaciones iniciales alrededor del eje Y (aquí denominada rotación φ) (Fig. S9, paso 2). A continuación, se combinaron partículas de las mismas formas con el mismo número de protofilamentos para su posterior procesamiento. El progreso de SVA se monitoreó mediante la inspección de modelos de pines en UCSF Chimera (Fig. 2e), donde la posición y orientación de cada partícula se representaron mediante un par de marcadores. Esto nos permitió, por ejemplo: identificar y eliminar valores atípicos de la geometría lineal. Las partículas se podaron si se superponían con otras, tenían un coeficiente de correlación cruzada bajo o se alejaban demasiado de sus posiciones iniciales. Los mapas SPMT se afilaron usando factores B arbitrarios usando Bsoft65.

Habiendo determinado la polaridad relativa, el paso necesario para la combinación es encontrar la rotación φ relativa (rotación alrededor del eje de simetría) entre los microtúbulos individuales. Esto podría hacerse alineando cada partícula individual con una referencia común, pero daría lugar a una gran cantidad de errores debido a la baja relación señal/ruido. Desarrollamos un método análogo al de Zabeo et al.,25 donde los volúmenes promedio de los microtúbulos se alinean para encontrar su rotación φ relativa (Fig. S9, paso 4). Estas rotaciones φ se aplicaron luego a sus respectivas partículas y se alinearon con una referencia común. Posteriormente se realizó SVA con volúmenes agrupados 4 y 2 veces. Solo los datos de esporozoítos se alinearon con volúmenes no clasificados; el paso final fue reemplazar los volúmenes reconstruidos con los conjuntos completos de inclinaciones por volúmenes reconstruidos con inclinaciones entre ±24°. No se realizó ninguna búsqueda de rotación con el rango de inclinación restringido. El mapa C1 EM resultante era anisotrópico alrededor del eje de pseudosimetría debido a una distribución desigual de las orientaciones rotacionales de los microtúbulos. Para abordar esto, las partículas se separaron en clases por orientación y se eliminaron las partículas con los coeficientes de correlación cruzada más bajos en las clases más abundantes. Esto redujo el número de partículas de 24028 a 13263 en esporozoitos y de 8377 a 1851 en conjuntos de datos de oocinetos.

Se procesaron individualmente aproximadamente 200 microtúbulos de 25 tomogramas, con rotaciones φ iniciales aleatorias. Luego, los datos se clasificaron manualmente por número de protofilamento, se rotaron a la misma polaridad y se alinearon con volúmenes agrupados 4 y 2 veces. Los parámetros helicoidales se midieron directamente utilizando los promedios de clase con la excepción de las clases de 13 y 15 protofilamentos en las que no se resolvieron las subunidades de tubulina y se usaron los parámetros publicados (Tabla S2)71. Se aplicó simetría helicoidal, seguida de alineación SVA.

Los dobletes de SPMT se procesaron de manera análoga a los datos de oocinetos y esporozoitos, donde se usaron volúmenes promedio para determinar las rotaciones relativas de φ. Los SPMT con diferentes números de protofilamentos en los túbulos A y B se combinaron, lo que resultó en un volumen promedio de conjunto.

Las partículas se dividieron en dos mitades (partículas pares e impares). Se agregaron compensaciones de coordenadas aleatorias de hasta ±2 nm y compensaciones angulares aleatorias de hasta ±3° a cada partícula y los parámetros resultantes se usaron para regenerar un promedio bruto para cada medio conjunto de datos. Luego, la alineación de las dos mitades se realizó de forma independiente con volúmenes agrupados dos veces y luego sin agrupar, siguiendo el mismo procedimiento que el conjunto de datos completo. La correlación de Fourier Shell se midió utilizando Bsoft.

Los mapas EM y los modelos atómicos se visualizaron con UCSF (Universidad de California en San Francisco) Chimera72 o UCSF ChimeraX73. Las secciones computacionales se generaron en IMOD.

Se utilizó ClustalOmega74,75 para alinear las secuencias de la proteína TrxL1 y JalView para la visualización76. Los colores se basan en la coloración ClustalX.

La segmentación se realizó manualmente en IMOD, utilizando herramientas de dibujo seguidas de interpolación lineal. Los modelos resultantes se utilizaron para extraer volúmenes segmentados. Los SPMT, el conoide de oocineto y el APR de esporozoíto se trazaron de nuevo: los volúmenes promedio se colocaron en volúmenes 3D usando las coordenadas determinadas por SVA. Las partículas SPMT y APR se ajustaron en ranuras para suavizar los errores de alineación para la visualización. Los volúmenes segmentados y retrográficos se visualizaron utilizando UCSF ChimeraX73.

Los tomogramas se filtraron con paso de banda usando Bsoft. Las segmentaciones de los tomogramas filtrados fueron guiadas por un algoritmo de votación de tensor utilizando TomoSegMemTV77,78. Los parámetros se optimizaron para cada conjunto de datos, respectivamente. Los grupos que contenían las segmentaciones de IMC se extrajeron manualmente mediante análisis visual. A continuación, los grupos se convirtieron en una nube de puntos 3D y se procesaron posteriormente con la biblioteca Open3D78. Se utilizó un análisis estadístico de valores atípicos para eliminar el exceso de ruido de las segmentaciones. Posteriormente, se usó el algoritmo DBSCAN para separar secciones de membrana individuales y el lado exterior del IMC se seleccionó manualmente para mediciones de distancia posteriores. El ángulo φIMC se midió entre dos vectores para cada partícula SPMT: un vector del eje X de la partícula SPMT y un vector desde el centro de la partícula hasta la coordenada IMC segmentada más cercana (aproximadamente equivalente al vector normal IMC que intersecta la partícula SPMT). Se excluyeron las partículas fuera de los parches de membrana segmentada. Las mediciones de los microtúbulos individuales se redujeron a un valor medio para la representación gráfica y los análisis estadísticos.

El requisito de una densidad de membrana clara para la segmentación automatizada redujo sustancialmente el número de microtúbulos disponibles para el análisis. Por lo tanto, debido a la rareza de los SPMT en los merozoítos, los dobletes en los gametocitos y los extremos negativos en los ooquinetos, se segmentó manualmente un pequeño número de tomogramas en IMOD.

Inicialmente, el modelo SPMT de T. gondii (PDB 7MIZ) se ajustó al mapa EM de SPMT de esporozoíto de P. falciparum como un cuerpo rígido en Chimera72, luego se visualizó el ajuste en ChimeraX73. El ajuste resultante fue inequívoco con TgTrxL2 (que no se expresa en Plasmodium pero es parte de Toxoplasma ILH) fuera y las cadenas de proteínas restantes dentro del mapa. Debido a la diferencia de elipticidad entre los mapas de P. falciparum y T. gondii, los protofilamentos y los medios arcos de TrxL1/SPM1 se ajustaron como unidades separadas. La predicción estructural de PfTrxL1 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q8I2W0)79 se alineó con TgTrxL1 (PDB 7MIZ) usando matchmaker80 en ChimeraX.

Los ángulos entre protofilamentos se determinaron midiendo el ángulo entre los átomos de Cα del mismo par de residuos en protofilamentos vecinos. Se utilizaron valores medios de aproximadamente 200 mediciones.

El etiquetado endógeno se realizó esencialmente como se describió antes utilizando la integración81 de cruce único. Como tanto SPM1 como TrxL1 muestran una longitud génica total de menos de 1 kilobase, el marco de lectura abierto completo se amplificó a partir del ADN genómico de tipo salvaje de PbANKA. El fragmento de ADN resultante se clonó en el vector82 pL18 utilizando los sitios de restricción EcoRI y BamHI. El cebador inverso codificaba seis alaninas que se usaban como enlazador. El vector pL18 alberga el gen hDHFR para selección positiva utilizando el fármaco pirimetamina. Antes de la transfección, el vector se linealizó utilizando SwaI (SPM1) y BsmI (TrxL1), respectivamente, seguido de precipitación con etanol. Todos los oligonucleótidos utilizados para generar fragmentos de ADN, así como los utilizados para el genotipado de las PCR, se enumeran en la Tabla 1.

Cada uno de los vectores pL18-SPM1-GFP/pL18-TrxL1-GFP linealizados se transfectó en una cepa ANKA de P. berghei sin modificar usando protocolos estándar83. Los parásitos que integraron la construcción de ADN deseada se seleccionaron mediante la administración oral de pirimetamina (0,07 mg/ml) a través del agua de bebida del ratón un día después de la transfección. Una vez que los ratones mostraron entre 1 y 3 % de glóbulos rojos infectados, se recolectó sangre mediante punción cardíaca de ratones anestesiados (100 mg/kg de ketamina y 3 mg/kg de xilazina, Sigma-Aldrich). Para el almacenamiento permanente de la línea de parásitos, se almacenaron en nitrógeno líquido alícuotas de 100 µl de sangre entera mezclada con 200 µl de solución de congelación (glicerol al 10 % en solución de Alsever, Sigma-Aldrich).

Para verificar la integración correcta, se aisló el ADN genómico de sangre completa y se analizó la integración correcta del constructo mediante PCR de genotipado. Para ello, primero se lisaron los eritrocitos en 1,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía saponina al 0,03%. Después de la centrifugación y dos pasos de lavado, el ADN genómico se aisló usando el kit Blood and Tissue (Qiagen Ltd) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los parásitos de estas transfecciones dieron como resultado poblaciones mixtas (parentales) que se utilizaron para las infecciones por mosquitos.

Los plásmidos y los oligonucleótidos se diseñaron utilizando la versión 3.2.1 del software SnapGene (Insightful Science, disponible en snapgene.com). Las imágenes fueron analizadas con Fiji (Versión: 2.0.0 rc 64/1.51 s)84.

Las reservas de parásitos congeladas (no clonales) se descongelaron y se inyectaron directamente por vía intraperitoneal (100 a 150 µl) en un ratón (ratones suizos hembra de 6 a 8 semanas de edad) con la infección monitoreada mediante frotis de sangre. Una vez que el ratón infectado alcanzó un 2-3 % de glóbulos rojos infectados, se anestesió al ratón (100 mg/kg de ketamina y 3 mg/kg de xilazina, Sigma-Aldrich), se extrajo sangre y se transfirieron 20 millones de parásitos a dos ratones receptores vírgenes mediante inyección intraperitoneal. Tres días después de la transferencia de sangre fresca, se anestesiaron los ratones (120 mg/kg de ketamina y 16 mg/ml de xilazina) y se colocaron en una jaula que contenía alrededor de 200 mosquitos Anopheles stephensi hembra, que se privaron de alimento durante 3 a 5 h mediante la eliminación de almohadillas de azúcar y sal. . Se permitió que los mosquitos se alimentaran de los ratones durante 15 min a 30 min. Después de la infección, los mosquitos se mantuvieron a 21 °C y 70 % de humedad.

Los esporozoítos de las glándulas salivales se aislaron el día 19 después de la ingesta de sangre de mosquito. Para ello, las glándulas salivales se disecaron en hielo en RPMI y se trituraron con un mortero. Posteriormente, el tubo se llenó hasta 1 ml con RPMI y la solución se cubrió cuidadosamente con 3 ml de Accudenz al 17% (cooperación científica y química precisa). La centrifugación a 1600 xg durante 20 min a temperatura ambiente separó los esporozoitos de los restos celulares. Se recogió la interfase que contenía esporozoitos (volumen total de 1,4 ml) y los esporozoitos se centrifugaron durante 3 min a 100 xg (Thermo Fisher Scientific, Biofuge primo). La resuspensión de esporozoitos granulados en RPMI que contenía albúmina de suero bovino (ROTH) al 3 % dio como resultado esporozoitos activados. La mezcla resultante se transfirió a un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo óptico (Thermo Fisher Scientific) y la placa se centrifugó durante 3 min a 200 xg (Multifuge S1-R, Heraeus). Se tomaron imágenes de los esporozoitos usando un microscopio de epifluorescencia (CellObserver, Zeiss) y un objetivo de 25x (NA 0.8, agua) con una exposición de 80 ms. Las imágenes se tomaron hasta 1 h después de la activación del esporozoito.

Se tomaron imágenes de fluorescencia de parásitos vivos en un microscopio de fluorescencia Leica D6B equipado con una cámara Leica DFC9000 GT y un objetivo de aceite Leica Plan Apochromat 60x o 100x / 1.4. El contraste y las intensidades se ajustaron linealmente para presentar formas de parásitos claras usando Fiji y las imágenes recortadas se ensamblaron en una composición de celdas para la Fig. 1 usando Adobe Illustrator CC 2021.

Se generaron cinco preparaciones de gametocitos de P. falciparum de las cuales se tomaron imágenes de seis cuadrículas, se generaron cinco preparaciones de esquizontes de P. falciparum de las cuales se tomaron imágenes de seis cuadrículas, se generaron dos preparaciones de esporozoitos de P. falciparum de las cuales se tomaron imágenes de cuatro cuadrículas y dos preparaciones de P. berghei se generaron ookinetes de los cuales se tomaron imágenes de tres cuadrículas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los promedios de subvolumen generados en este estudio se han depositado en la EMDB con los códigos de acceso Sporozoite MT (EMD-15532), Gametocyte MTs: 13pf (EMD-15534), 14pf (EMD-15535), 15pf (EMD-15536), 16pf ( EMD-15537), 17pf (EMD-15538), 18pf (EMD-15539). Los datos de medición de distancia generados en este estudio se proporcionan en el archivo de datos de origen. Todas las cepas y plásmidos están disponibles a pedido. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Chaaban, S. & Brouhard, GJ Un bestiario de microtúbulos: diversidad estructural en polímeros de tubulina. mol. Biol. Celda 28, 2924–2931 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chalfie, M. & Thomson, JN Diversidad estructural y funcional en los microtúbulos neuronales de Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 93, 15–23 (1982).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Davis, C. & Gull, K. Número de protofilamentos en microtúbulos en células de dos nematodos parásitos. J. Parasitol. 69, 1094–1099 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Saito, K. & Hama, K. Diversidad estructural de microtúbulos en las células de soporte del epitelio sensorial del órgano de corti del conejillo de indias. J. Microscopía electrónica. (Tokio) 31, 278–281 (1982).

CAS PubMed Google Académico

Tucker, JB, Paton, CC, Richardson, GP, Mogensen, MM & Russell, IJ Una capa centrosomal asociada a la superficie celular de material organizador de microtúbulos en la célula del pilar interno de la cóclea del ratón. J. ciencia celular. 102, 215–226 (1992).

Artículo PubMed Google Académico

Ferreira, JL et al. Los roles dinámicos del complejo de la membrana interna en las múltiples etapas del parásito de la malaria. Frente. Celúla. Infectar. Microbiol. 10, 611801 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Harding, CR & Frischknecht, F. Las fascinantes estructuras celulares de los parásitos apicomplejos. Tendencias Parasitol. 36, 979–991 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Harding, CR & Meissner, M. El complejo de la membrana interna a través del desarrollo de toxoplasma gondii y plasmodium. Celúla. Microbiol. 16, 632 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, J. et al. Un conjunto de proteínas dirigidas específicamente estabiliza los microtúbulos corticales en el parásito humano toxoplasma gondii. mol. Biol. Celda 27, 549–571 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morrissette, NS & Sibley, LD Citoesqueleto de parásitos apicomplejos. Microbiol. mol. Biol. Rev. 66, 21–38 (2002).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Cyrklaff, M. et al. La tomografía crioelectrónica revela material periódico en el lado interno de los microtúbulos subpeliculares en parásitos apicomplejos. Exp. J. Med 204, 1281–1287 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tran, JQ, Li, C., Chyan, A., Chung, L. y Morrissette, NS SPM1 estabiliza los microtúbulos subpeliculares en toxoplasma gondii. eucariota. Celda 11, 206–216 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, K., Roos, DS y Murray, JM Un nuevo polímero de tubulina forma el conoide de toxoplasma gondii. J. Cell Biol. 156, 1039–1050 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sol, SY et al. Cryo-ET de parásitos de Toxoplasma proporciona una visión subnanométrica de las estructuras basadas en tubulina. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 119, e2111661119 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koreny, L. et al. La caracterización molecular del complejo conoide en Toxoplasma revela su conservación en todos los apicomplejos, incluidas las especies de Plasmodium. PLOS Biol. 19, e3001081 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pierson, GB, Burton, PR & Himes, RH Alteraciones en el número de protofilamentos en microtúbulos ensamblados in vitro. J. Cell Biol. 76, 223–228 (1978).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Oakley, BR, Paolillo, V. & Zheng, Y. Complejos de γ-tubulina en la nucleación de microtúbulos y más allá. mol. Biol. Celda 26, 2957–2962 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wieczorek, M. et al. Arquitectura molecular asimétrica del complejo de anillo de γ-tubulina humana. Celda 180, 165–175.e16 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Manka, SW y Moores, CA Las pseudorrepeticiones en la doblecortina hacen distintas contribuciones mecánicas a la regulación de los microtúbulos. EMBO Rep. 21, e51534 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moores, CA et al. Mecanismo de estabilización de microtúbulos por doblecortina. mol. Celda 14, 833–839 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fukushige, T. et al. MEC-12, una tubulina alfa necesaria para la sensibilidad al tacto en C. elegans. J. ciencia celular. 112, 395–403 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cueva, JG, Hsin, J., Huang, KC & Goodman, MB La acetilación postraduccional de la tubulina α restringe el número de protofilamentos en los microtúbulos nativos. actual Biol. CB 22, 1066–1074 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Russell, DG & Burns, RG El anillo polar de los esporozoitos coccidianos: un centro organizador de microtúbulos único. J. ciencia celular. 65, 193–207 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sosa, H. & Chrétien, D. Relación entre patrones de muaré, forma de tubulina y polaridad de microtúbulos. Móvil celular. Citoesqueleto. 40, 38–43 (1998).

3.0.CO;2-B" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0169%281998%2940%3A1%3C38%3A%3AAID-CM4%3E3.0.CO%3B2-B" aria-label="Article reference 24" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0169(1998)40:13.0.CO;2-B">Artículo CAS Google Académico

Zabeo, D. et al. Una hélice interrumpida lumenal en los microtúbulos de la cola del espermatozoide humano. ciencia Rep. 8, 2727 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leung, MR et al. La arquitectura multiescala de los flagelos de los espermatozoides de mamíferos y las implicaciones para la motilidad ciliar. EMBO J. 40, e107410 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, X. et al. La estructura crio-EM de los microtúbulos corticales del parásito humano toxoplasma gondii identifica las proteínas internas de sus microtúbulos. Nat. común 12, 3065 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bertiaux, E. et al. La microscopía de expansión proporciona nuevos conocimientos sobre el citoesqueleto de los parásitos de la malaria, incluida la conservación de un conoide. PLOS Biol. 19, e3001020 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salmon, BL, Oksman, A. & Goldberg, DE Salida del parásito de la malaria del eritrocito huésped: un proceso de dos pasos que requiere la proteólisis extraytrocítica. proc. Academia Nacional. ciencia 98, 271–276 (2001).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Simón, CS et al. Un compartimento intranuclear libre de ADN extendido organiza los microtúbulos del centrosoma en los parásitos de la malaria. Ciencias de la vida Alianza 4, e202101199 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dearnley, MK et al. Origen, composición, organización y función del complejo de membrana interna de los gametocitos de Plasmodium falciparum. J. ciencia celular. 125, 2053–2063 (2012).

CAS PubMed Google Académico

Fisch, C. & Dupuis-Williams, P. Ultraestructura de cilios y flagelos: ¡regreso al futuro! Biol. Celda 103, 249–270 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Sinden, RE, Canning, EU, Bray, RS, Smalley, ME y Garnham, PCC Desarrollo de gametocitos y gametos en Plasmodium falciparum. proc. R. Soc. largo B Biol. ciencia 201, 375–399 (1978).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Schneider, MP et al. La alteración del ensamblaje del complejo de la membrana interna bloquea el desarrollo de la etapa sexual del Plasmodium falciparum. Patograma de PLOS. 13, e1006659 (2017).

Artículo Google Académico

Kudryashev, M. et al. Base estructural de la quiralidad y la motilidad direccional de los esporozoitos de plasmodio. Celúla. Microbiol. 14, 1757-1768 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt-Cernohorska, M. et al. El ensamblaje del doblete de microtúbulos flagelares in vitro revela un papel regulador de las colas C-terminales de tubulina. Ciencia 363, 285–288 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Ti, S.-C., Alushin, GM y Kapoor, TM Los isotipos de β-tubulina humana pueden regular el número y la estabilidad de los protofilamentos de los microtúbulos. desarrollo Celda 47, 175–190.e5 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

López-Barragán, MJ et al. Expresión génica direccional y transcripciones antisentido en estadios sexuales y asexuales de Plasmodium falciparum. Genoma BMC. 12, 587 (2011).

Artículo Google Académico

Zanghì, G. et al. Un PfEMP1 específico se expresa en los esporozoitos de P. falciparum y desempeña un papel en la infección de los hepatocitos. Representante celular 22, 2951–2963 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hirst, WG et al. La purificación de tubulina funcional de Plasmodium falciparum permite la identificación de inhibidores de microtúbulos específicos de parásitos. actual Biol. 32, 919–926.e6 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, M. et al. Descubriendo el genoma esencial del parásito de la malaria humana Plasmodium falciparum mediante mutagénesis por saturación. Ciencia 360, eaap7847 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Spreng, B. et al. El número y la longitud de los microtúbulos determinan la forma y función celular en el plasmodio. EMBO J. 38, e100984 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Dixon, MWA & Tilley, L. Plasmodium falciparum se vuelve loco por el sexo. mol. Bioquímica Parasitol. 244, 111385 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, J. et al. Reutilización de la maquinaria mitótica para impulsar el alargamiento celular y la reorganización de la cromatina en los gametocitos de Plasmodium falciparum. Nat. común 13, 5054 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tiburcio, M. et al. Un cambio en la deformabilidad de los eritrocitos infectados en la maduración y circulación sanguínea de las etapas de transmisión de Plasmodium falciparum. Sangre 119, e172–e180 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Duez, J. et al. Retención esplénica de gametocitos de Plasmodium falciparum para bloquear la transmisión de la malaria. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 59, 4206–4214 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J. y Howard, J. Rigidez a la flexión de microtúbulos y filamentos de actina medidos a partir de fluctuaciones térmicas en la forma. J. Cell Biol. 120, 923–934 (1993).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gómez-Díaz, E. et al. Regulación epigenética de la expresión génica clonalmente variante de Plasmodium falciparum durante el desarrollo en Anopheles gambiae. ciencia Rep. 7, 40655 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sadek, CM et al. Caracterización de la tiorredoxina humana similar a la tiorredoxina 2. Una nueva tiorredoxina de unión a microtúbulos expresada predominantemente en los cilios del epitelio de las vías respiratorias pulmonares y la mancheta y el axonema de la espermátida. J. Biol. química 278, 13133–13142 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Miranda-Vizuete, A. et al. El sistema de tiorredoxina específico de los testículos de mamíferos. antioxidante Señal redox. 6, 25–40 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

de León, JC et al. Una proteína similar a SAS-6 sugiere que el complejo de conoides de toxoplasma evolucionó a partir de componentes flagelares. eucariota. Celda 12, 1009–1019 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Pared, RJ et al. La proteína similar a SAS6 en plasmodio indica que las proteínas complejas apicales asociadas con conoides persisten en etapas invasivas dentro del mosquito vector. ciencia Rep. 6, 28604 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fowler, RE et al. Proteínas motoras asociadas a microtúbulos de merozoítos de Plasmodium falciparum. mol. Bioquímica Parasitol. 117, 187–200 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Trager, W. & Jensen, JB Cultivo continuo de plasmodium falciparum: su impacto en la investigación de la malaria. En t. J. Parasitol. 27, 989–1006 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rivadeneira, EM, Wasserman, M. & Espinal, CT Separación y concentración de esquizontes de plasmodium falciparum por gradientes de percoll1. J. Protozool. 30, 367–370 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bullen, HE et al. Una nueva familia de proteínas asociadas a glideosomas de apicomplejos con una función de anclaje de la membrana interna. J. Biol. química 284, 25353–25363 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kono, M. et al. Evolución y arquitectura del complejo de membranas internas en estadios asexuales y sexuales del parásito de la malaria. mol. Biol. Evol. 29, 2113–2132 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Baker, DA et al. Una potente serie dirigida a la proteína quinasa dependiente de cGMP de la malaria elimina la infección y bloquea la transmisión. Nat. común 8, 430 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Donald, RGK et al. Inhibidores de la quinasa anticoccidial: identificación de objetivos de proteína quinasa secundarios a proteína quinasa dependiente de cGMP. mol. Bioquímica Parasitol. 149, 86–98 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Boltryk, SD et al. Líneas productoras de gametocitos inducibles diseñadas por CRISPR/Cas9 como una herramienta valiosa para la investigación de la transmisión de la malaria por Plasmodium falciparum. Nat. común 12, 4806 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Winkel, BMF y col. Cuantificación de la motilidad de esporozoitos de Plasmodium falciparum de tipo salvaje y atenuados por radiación en la piel humana. ciencia Rep. 9, 13436 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schaffer, M. et al. Preparación de muestras con haz de iones enfocados en crio para obtener imágenes de células vítreas mediante tomografía crioelectrónica. Bio-Protocolo. 5, e1575 (2015).

Artículo PubMed Google Académico

Mastronarde, DN Tomografía de doble eje: un enfoque con métodos de alineación que preservan la resolución. J. Estructura. Biol. 120, 343–352 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kremer, JR, Mastronarde, DN & McIntosh, JR Visualización por computadora de datos de imágenes tridimensionales usando IMOD. J. Estructura. Biol. 116, 71–76 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Heymann, JB Bsoft: imagen y procesamiento molecular en microscopía electrónica. J. Estructura. Biol. 133, 156–169 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Heumann, JM, Hoenger, A. & Mastronarde, DN Clustering y mapas de varianza para tomografía crioelectrónica utilizando diferencias enmascaradas en cuña. J. Estructura. Biol. 175, 288–299 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Cragnolini, T. et al. TEMPy2: una biblioteca de Python con flujos de trabajo de validación y ajuste de densidad de microscopía electrónica 3D mejorados. Acta Crystallogr. Secta. Estructura. Biol. 77, 41–47 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Harris, CR et al. Programación de matrices con NumPy. Naturaleza 585, 357–362 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hunter, JD Matplotlib: un entorno de gráficos 2D. computar ciencia Ing. 9, 90–95 (2007).

Artículo Google Académico

Virtanen, P. et al. SciPy 1.0: algoritmos fundamentales para la computación científica en Python. Nat. Métodos 17, 261–272 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sui, H. & Downing, KH Base estructural de la interacción entre protofilamentos y la deformación lateral de los microtúbulos. Estructura. largo ingl. 1993 18, 1022–1031 (2010).

CAS Google Académico

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Cómputo. química 25, 1605–1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Pettersen, EF et al. UCSF chimeraX: visualización de estructuras para investigadores, educadores y desarrolladores. Ciencia de las proteínas 30, 70–82 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Goujon, M. et al. Un nuevo marco de herramientas de análisis de bioinformática en EMBL-EBI. Ácidos nucleicos Res 38, W695–W699 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sievers, F. et al. Generación rápida y escalable de alineaciones de secuencias múltiples de proteínas de alta calidad utilizando clustal omega. mol. sist. Biol. 7, 539 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Waterhouse, AM, Procter, JB, Martin, DMA, Clamp, M. & Barton, GJ Jalview versión 2: un banco de trabajo de análisis y editor de alineación de secuencias múltiples. Bioinformática 25, 1189–1191 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martinez-Sanchez, A., Garcia, I., Asano, S., Lucic, V. & Fernandez, J.-J. Detección de membrana robusta basada en votación de tensor para tomografía electrónica. J. Estructura. Biol. 186, 49–61 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Zhou, Q.-Y., Park, J. & Koltun, V. Open3D: una biblioteca moderna para el procesamiento de datos 3D. ArXiv180109847 Cs (2018).

Jumper, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meng, EC, Pettersen, EF, Couch, GS, Huang, CC y Ferrin, TE Herramientas para el análisis integrado de secuencias y estructuras con UCSF Chimera. BMC Bioinforma. 7, 339 (2006).

Artículo Google Académico

Wichers-Misterek, JS et al. Una proteína asociada a microtúbulos es esencial para la transmisión del parásito de la malaria. mBío. 14, e0331822 (2023).

Kehrer, J. et al. El etiquetado de proximidad basado en APEX en Plasmodium identifica una proteína de membrana con funciones duales durante la infección por mosquitos. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.09.29.318857 (2022).

Janse, CJ, Ramesar, J. & Waters, AP Transfección de alta eficiencia y selección de fármacos de etapas de sangre transformadas genéticamente del parásito de la malaria de roedores Plasmodium berghei. Nat. Protocolo https://doi.org/10.1038/nprot.2006.53 (2006).

Schindelin, J. et al. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Nat. Métodos 9, 676–682 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

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Nos gustaría agradecer a las instalaciones CSSB Cryo-EM y ALFM por su apoyo. Agradecemos a Till Voss por los parásitos 3D7-iGP, TropIQ por proporcionar los esporozoitos de P. falciparum y Andrew Waters y Katie Hughes por compartir la línea PbRFP. Gracias a Lindsay Baker por sus comentarios críticos sobre los resultados y a John Heumann y Carolyn Moores por sus valiosos debates y consejos. Gracias a la comunidad de Stackoverflow por ser un repositorio de conocimiento aparentemente sin fondo y que restaura la cordura. Este trabajo fue financiado por: Beca postdoctoral a largo plazo HFSP LT000024/2020-L (JLF), Infraestructuras para el control de enfermedades transmitidas por vectores (Infravec2) financiada por el programa Horizonte 2020 de la UE (acuerdo de subvención No 731060) (JLF), Programa posdoctoral interdisciplinario EMBL bajo las acciones de Marie Curie COFUND MSCA-COFUND-FP (número de acuerdo de subvención: 847543) (MS), Centro Alemán para la Investigación de Infecciones, DZIF (FH), DFG-FR 2140/10-1 (AMB), investigación DFG redes SFB 1129, SPP 2332 y subvención FR 2140/10-1 (FF), CSSB KIF-002 (TWG y KG), redes de investigación DFG SPP 2225 (TWG), subvenciones Wellcome Trust 107806/Z/15/Z y 209250/ Z/17/ Z (KG), subvención BMBF 05K18BHA (KG), DFG INST 152/ 772-1, 774-1, 775-1, 777-1 FUGG (instalación CSSB cryoEM).

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

josie l ferreira

Dirección actual: Instituto de Biología Estructural y Molecular, Birkbeck, Universidad de Londres, Londres, Reino Unido

Estos autores contribuyeron igualmente: Josie L. Ferreira, Vojtěch Pražák.

Centro de Biología de Sistemas Estructurales, Hamburgo, Alemania

Josie L. Ferreira, Vojtěch Pražák, Daven Vasishtan, Marc Siggel, Emma Pietsch, Jan Kosinski, Tim W. Gilberger y Kay Grünewald

Instituto Leibniz de Virología (LIV), Hamburgo, Alemania

Josie L. Ferreira, Vojtěch Pražák, Daven Vasishtan y Kay Grünewald

Instituto Bernhard Nocht de Medicina Tropical, Hamburgo, Alemania

Josie L Ferreira, Emma Pietsch y Tim W Gilberger

División de Biología Estructural, Centro Wellcome de Genética Humana, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Vojtěch Pražák, Daven Vasishtan y Kay Grünewald

Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Hamburgo, Alemania

Marc Siggel y Jan Kosinski

Parasitología Integrativa, Centro de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina de la Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania

Franziska Hentzschel, Annika M. Binder y Friedrich Frischknecht

Centro Alemán para la Investigación de Infecciones, sitio asociado de DZIF Heidelberg, Heidelberg, Alemania

Franziska Hentzschel y Friedrich Frischknecht

Universidad de Hamburgo, Hamburgo, Alemania

Emma Pietsch, Tim W. Gilberger y Kay Grünewald

Unidad de Biología Estructural y Computacional, EMBL, Heidelberg, Alemania

Jan Kosinski

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JLF y EP cultivaron parásitos en estadio de sangre, AMB y FH prepararon parásitos en estadio de mosquito. AMB generó líneas transgénicas de P. berghei y realizó experimentos de localización de fluorescencia. JLF realizó microscopía de fluorescencia, preparación de rejillas EM, fresado FIB y recopilación de datos de microscopía electrónica. JLF y VP realizaron procesamiento de datos de tomografía, promedio de subvolumen y análisis de polaridad. VP y DV realizaron un análisis adicional de los datos de tomografía, incluido el análisis de elipticidad y el ajuste. VP y MS realizaron análisis de distancia y ángulo en datos de tomografía. JLF, VP y MS realizaron la segmentación del tomograma. Cifras preparadas por JLF, VP, AMB y EP. JK, FF, TWG y KG supervisaron el proyecto. JLF y VP escribieron el texto original del manuscrito y fue revisado y editado por JLF, VP, DV, MS, FH, EP, JK, FF, TWG, KG.

Correspondencia a Kay Grünewald.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Para los experimentos in vivo, incluida la propagación de parásitos y las infecciones por mosquitos, se utilizaron ratones suizos hembra de 8 a 10 semanas de edad obtenidos de los laboratorios de Janvier. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas relativas a la categoría B de FELASA y las pautas estándar de GVSOLAS. Los experimentos con animales fueron aprobados por las autoridades alemanas (Regierungspraesidium Karlsruhe, Alemania), § 8 Abs. 1 Tierschutzgesetz (TierSchG) bajo la licencia G-111/20 y se realizaron de acuerdo con la normativa nacional y europea.

Nature Communications agradece a Andreas Hoenger, Leann Tilley y Li-Av Segev Zarko por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Ferreira, JL, Pražák, V., Vasishtan, D. et al. Arquitectura de microtúbulos variable en el parásito de la malaria. Común Nat 14, 1216 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36627-5

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Recibido: 07 noviembre 2022

Aceptado: 09 febrero 2023

Publicado: 03 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36627-5

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